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禽病与生物兽药研究室
作者:
    一、负责人
    副主任:欧阳伟(主持工作)  刘青涛
    二、团队成员
    王晓丽、潘群兴、欧阳伟、诸玉梅、夏兴霞、毕振威、孟凯、刘宇卓、赵冬敏、韩凯凯、黄欣梅、刘青涛、杨婧
    三、研究方向
    1、禽类传染性法氏囊病病毒病原学、流行病学、免疫与致病的分子机理、高效培养技术、新型疫苗和检测试剂盒等。
    2、水禽坦布苏病毒病流行病学规律、发病机理、病原生物学特性,抗原抗体检测试剂盒和该病灭活疫苗和弱毒疫苗。
    3、禽流感病原基因演变规律研究和致病机理研究,胶体金快速诊断试剂盒和高保护率疫苗的研究。
    4、犬类疾病的流行病学监测、治疗性单克隆抗体、干扰素细胞因子等新型治疗剂和检测试剂盒。
    四、承担项目
    2012年以来,共承担国家级、部省级研究课题36项,院市级项目3项。其中国家自然科学基金7项、国家科技支撑计划课题1项、国家重点研发计划项目2项、江苏省自然科学基金6项、江苏省优秀青年基金项目1项、江苏省农业科技自主创新资金11项、中国博士后科学基金项目一类和二类各1项、江苏省博士后科研资助计划基金(B类)项目1项、江苏省级其它计划(省农业地方标准)项目3项、江苏省农业科学院基本科研业务专项3项、院企新兽药合作研发项目2项。
    五、研究成果
    近五年来,发表研究论文71篇,其中SCI收录18篇;申请国家发明专利20项,授权14项;获得国家三类新兽药注册证书1项;获得江苏省地方标准4项;获得大北农科技奖三等奖1项、南京市科技进步二等奖1项、江苏省农科院科技进步二等奖1项。
    六、主要进展
    1、禽类传染性法氏囊病研究:在传染性法氏囊病病毒(IBDV)病原学与流行病学方面,建立了多种IBDV的检测与鉴定方法,改进了IBDV分离方法,分析了IBDV流行毒株的生物学特性与遗传变异状况,获得了多株超强毒株(vvIBDV)、基因重配(reassortment)毒株和高免疫原性毒株,分析了影响IBD免疫预防的主要因素,阐述了非鸡鸟类在IBDV传播和变异中起重要作用;在免疫与致病的分子机理方面,分析了 IBDV感染对鸡体天然免疫功能的影响,发现了多个细胞内源性microRNA(miRNA)和模式识别受体(PRR)在调控鸡体抗IBDV感染中起着关键作用,阐述了miRNA在鸡体内对干扰素介导的抗IBDV免疫应答的分子调控以及IBDV强毒株抑制鸡淋巴细胞TLR3和MDA5表达的分子调控机制;在IBDV高效培养技术方面,基于miRNA研究基础,构建成功DF-9细胞株,该细胞株具有优良的生物学特性,用该细胞株培养IBDV(A11株)可极大地降低生产成本、提高IBD疫苗的质量和免疫效力;在新型疫苗和检测试剂盒方面,用单克隆抗体分析了IBDV抗原表位及其性质,建立了模拟IBD多表位疫苗以及颗粒化表位型IBD基因工程疫苗制备方法,研发的火鸡疱疹病毒载体的重组传染性法氏囊病与马立克氏病二联活疫苗、鸡传染性法氏囊病病毒结构蛋白VP2抗体ELISA检测试剂盒正在按计划进行。以上研究成果已在解决禽类IBDV防控理论、关键技术、新型疫苗以及生产实践中发挥着重要作用。
    2、水禽坦布苏病毒病研究:在国际上第一个分离鉴定出鹅源坦布苏病毒JS804毒株;对比了坦布苏病毒(TMUV)在不同培养基质上的增殖滴度,研究了病毒的生物学特性,对JS804毒株进行了全基因组序列,登录号为JF895923,基因组全长10,916个核苷酸,只包含一个10,278bp的阅读框,编码3425个氨基酸;研究了不同来源(鸭源、鹅源)病毒对鸭胚、鸭和乳鼠(包括有无抗体和不同攻毒途径)的致病性,对鸭和鹅进行肌肉攻毒,通过观察病理变化和采用免疫组化法对各器官病毒进行检测,研究了病毒的组织嗜性和在体内移行规律;建立了检测病毒E蛋白基因的RT-PCR、套式RT-PCR方法,检测病毒NS5基因的RT-LAMP方法,基于E蛋白单抗的双抗体夹心ELISA和NS1蛋白单抗的双抗体夹心ELISA检测方法,针对NS2A基因的实时定量RT-PCR方法,研制了检测E蛋白抗体的间接ELISA试剂盒;制备了抗坦布苏病毒E蛋白和NS1蛋白的单克隆抗体并鉴定了其生物学特性;攻毒后病毒在鸭的脾脏、肺脏、心脏、肝脏、肾脏和脑中快速复制,鸭之间可以通过粪便、直接接触和空气进行有效传播,感染鸭从攻毒后第二天开始排毒并持续30天,病毒对小鼠具有较强的神经毒力和侵袭力,对人类健康具有潜在威胁,因此当发生坦布苏病毒病时应该采取严格的生物安全防控措施;用生物信息学分析方法预测了病毒的T、B细胞抗原表位,用表达的E蛋白研究了其免疫机理和免疫血清的病毒中和作用,分别表达了EⅢ、E-I/II和NS5蛋白,并初步研究了其作用;DF-1细胞表面的HSPA9可以与TMUV进行结合,并且可以抑制TMUV对细胞的吸附和感染,提示HSPA9是TMUV细胞表面受体的候选分子,在HSPA9与TMUV的相互作用中其羧基端结构域发挥了关键作用,可以作为抗TMUV药物研发的潜在分子靶点。
    3、禽流感研究:测定了1999年-2003年分离的4株鸭H9N2亚型禽流感病毒株各8个基因片段的基因序列,4株鸭H9N2亚型分离株为欧亚大陆禽分支Y280-like和Y439-like的重组病毒,排除由外界传入的可能;研究了从江苏、浙江发病鸭分离的4株H9N2亚型禽流感病毒的生物学特性,4株病毒对鸡和小鼠的致病力较低,对鸭均有一定的致病力,对鸭、鸡和小白鼠均有良好的免疫原性,掌握了H9N2禽流感病毒在鸡胚上的繁殖规律和静脉攻毒后在鸡体和鸭体某些组织器官中的动态分布;用NJ01毒株研制了鸭、鸡H9亚型禽流感灭活疫苗,2013年5月6日获得国家新兽药注册证书;2011年以后鸭源H9N2分离株和鸡源分离株分别属于属于9.4.1分支和9.4.2分支;2011-2012年江浙部分地区分离的14株鸡源H9N2亚型禽流感病毒均具有低致病性禽流感病毒的分子特征,HA基因属于Y280亚系,部分毒株糖基化位点的缺失,大多数分离株的226位受体结合位点为L,呈现出与人流感受体结合的特性,NA 基因属于 Y280亚系,分离株全部存在颈部缺失的现象,PA、PB1、NP基因全部属于SH/F/98亚群,多处氨基酸位点发生了突变,M基因属于G1亚群,NS基因则分属于两个亚群SH/F98和Y439,均具有能够逃避干扰素 IFN 和肿瘤坏死因子 TNF-α的抗病毒性,氨基酸也存在突变现象,PB2基因则完全独立形成一个新的亚群,但均不存在对小鼠的致死性,即8个片段基因分属于5个分支或亚群,14株病毒内部基因的进化树和同源性与2013年的H7N9病毒株同源性很高,只有1株病毒的NS基因属于Y439-like,与H7N9亲缘关系疏远,警示我们,对H9N2的监测要坚持不懈,积极做好预警;近4年的禽流感流行病学调查发现,家禽禽流感疫情虽然暴发较少,但家禽中病毒亚型呈现多样性,有H5N1、H5N2、H5N8、H9N2、H3N2、H6N6、H7N9等。 
    4、犬类疾病研究:分析了华东地区犬病流行现状、发病规律以及诊疗需求;建立了犬病生物防治性单克隆抗体技术研发平台,已研制成功犬瘟热病毒单克隆抗体、犬细小病毒单克隆抗体、犬流感病毒单克隆抗体、狂犬病病毒单克隆抗体,其中,犬瘟热病毒单克隆抗体已获得农业部兽用生物制品临床试验批件;建立了犬类细胞因子(活性肽)基因工程技术研发平台,已研制成功重组犬白蛋白-干扰素,在体内的半衰期是常规干扰素的5倍,疗效显著提高。
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